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一、斑马鱼的生物学特征及优势
斑马鱼是一种原产于南亚地区的小型热带淡水鱼,成鱼体长只有 3 厘米左右。斑马鱼发育速度快,受精后3 天左右主要组织器官发育已经完成,5 天左右开口进食,约 3 个月达到性成熟,寿命可达 2 年以上[1]。斑马鱼是体外受精发育而且胚体透明,组织器官的发育和变化、血流、心跳等都可以在显微镜下直接进行观察。
跟哺乳动物相比,斑马鱼具有饲养密度高(100 ㎡可养殖 2-3 万尾成年斑马鱼、养殖成本低(小鼠的 1/10)、实验通量高(可在 96 孔板中进行高通量分析)、所需要的样品量少(100mg 以内)、便于活体观察透明、实验周期短(大部分实验 5 天以内可以完成)、繁殖能力强(每队亲本一次可繁殖 200 枚左右胚胎)[2]。斑马鱼也更符合动物福利保护的要求。欧盟 2003 年颁布法令,要求从 2013 年起在欧盟禁止开展化妆品动物实验[3],而在 2010 年欧盟颁布的法令中明确指出,对于可以自由进食之前的斑马鱼(受精后 5 天以内)胚胎和幼鱼的使用不受欧盟有关动物实验禁令的限制[4]。
此外,不少低毒中药或保健食品因哺乳动物胃容量的限制,给样剂量有限,常常在在实验周期内难以发现受试样品的功效或毒性。斑马鱼实验通常是将药物直接溶解到养鱼水中,斑马鱼可以持续从养鱼水中摄取药物, 从而能够在较短时间内观察到受试样品无法在哺乳动物上观察到功效或毒性。目前,在中药、天然药物、保健食品以及功能性食品的研究开发当中,斑马鱼的使用越来月广泛。
二、国际上斑马鱼的应用现状与发展趋势
斑马鱼作为一种脊椎类模式动物在二十世纪九十年代开始进入新药研发领域,现已在欧美国家广泛应用于 人类疾病模型研究、新药筛选、药物毒性与安全性评价,应用领域覆盖了肿瘤、心脑血管疾病、神经系统疾病、代谢系统疾病以及抗炎与免疫系统疾病等几乎所有的人类疾病领域[2, 5-8]。
肿瘤领域。众多的研究成果表明斑马鱼模型在癌症发病机理研究和抗癌药筛选方面具有自身独特的优势10],Stoletov等人用斑马鱼研究清晰地揭示了肿瘤细胞通过血管向远端转移的机制[11]。斑马鱼模型目前已被广泛[9]应用于筛选抑制血管形成的靶向抗癌药[12,13],斑马鱼人类肿瘤移植模型也被大量用于抗肿瘤药物功效评价心血管疾病领域。研究发现,斑马鱼心脏功能和心电图与人的高度相似性,斑马鱼模型在筛选和评价心律不齐药物方面的结果具有很好的特异性和可靠性[16-18]。斑马鱼在研究心衰和筛选治疗心衰药物方面同样具有很大的价值[19],笔者所在的研究团队分别用特非那定[20]和维拉帕米[21]建立了两种不同机制的斑马鱼心衰模型,并且评价了芪苈强心胶囊、参麦注射液、厄贝沙坦、沙库巴曲缬沙坦钠片(LCZ696)等八种已上市心衰治疗药物, 发现斑马鱼实验结果与临床结果具有很好的一致性。斑马鱼也被广泛用于血栓形成研究以及抗血栓药物筛选23],通过苯肼诱发的红细胞损伤性血栓模型和通过花生四烯酸诱发的血小板聚集性血栓模型在已上市的抗血栓中药和化药的药效评价中都表现出了很好的相关性[24-26]。
神经系统疾病领域。斑马鱼很早就被用于癫痫研究和抗癫痫药物筛选[27-29],用斑马鱼癫痫模型对已上市的13 种抗癫痫进行的药效评价实验发现,除了扑米酮之外,其它 12 种药物在斑马鱼模型上都有明显的抗癫痫作用[27]。此外,斑马鱼在阿尔兹海默症领域也有较多的研究,包括对乙酰胆碱系统、Tau蛋白磷酸化以及β淀粉样蛋白对斑马鱼脑部神经和行为学的影响[30-33],也用斑马鱼阿尔兹海默症模型进行了药物筛选和评价研究[34]。 斑马鱼也用于神经生长与保护[35-37]、帕金森症[38]、多发性硬化[39]以及焦虑和认知障碍研究[40]。
代谢性疾病领域。研究发现斑马鱼对血糖的调控机制与哺乳动物相似[41],已上市的几种Ⅱ型糖尿病治疗药物都能显著降低斑马鱼高模型的血糖[42]。同时,斑马鱼也被用于研究胰腺 β 细胞再生的机制并用于筛选促进胰腺β细胞再生的化合物[43]。斑马鱼在脂肪代谢方面的研究比糖代谢方面的研究更多[44],斑马鱼被用于研究促进体内脂肪代谢进而开发减肥药物的研究[45]、用于筛选食物脂肪吸收抑制剂[46]、用于筛选和评价能够降低体内胆固醇水平的药物[47,48].
毒性评价方面。斑马鱼模型可以快捷、高效、直观地评价药物的心血管毒性、肝脏毒性、发育毒性、肾毒性和神经毒性等多个主要组织和器官毒性。斑马鱼对药物心血管毒性的预测准确性可以高达95%以上[16, 50, 51],对药物肝毒性的预测准确性可以达到 85%左右[52-54],对发育毒性的预测准确性可以达到 80%以上[55, 56]。已有的 大部分斑马鱼药物毒性与安全性评价模型的预测准确率已达到了“良好” (good)(75-85%)或优秀(excellent)(85%)的水平[57]。斑马鱼药物毒性评价技术的应用完善了整个临床前药物毒性与安全性评价体 系,可以加快临床前毒性评价的速度,降低临床前毒性评价的费用,提高新药研发成功率。
斑马鱼高通量、自动化药物筛选也在不断创新和发展,无论是斑马鱼高通量病理切片方法的研究[58]、行为学自动分析设备的开发[59]、自动化拍照设备的改进[60],还是基于斑马鱼体内荧光报告蛋白信号的自动化分析设备的开发[61],都将极大地推动斑马鱼模型在药物筛选与研发阶段的更广泛应用。
2009 年欧洲的一家斑马鱼药物筛选技术服务公司 Biobide(www.biobide.es)获得了美国食品与药品管理局(FDA)和欧洲药品评估局(EMEA)的 GLP 认证,标志着斑马鱼药物毒理学与安全性评价模型已经得到了欧美国家政府的正式认可。美国 FDA 也在其官网上刊文介绍斑马鱼在药物安全性评价方面的积极作用和价值(https://www.fda.gov/forconsumers/consumerupdates/ucm343940)。
三、斑马鱼技术在我国药物研发中的应用现状
斑马鱼在我国用于药物研发的时间相对较晚,大概开始于 2006 年前后,而且主要是以对中药材为主的天然药物活性成分的研究为主。这主要跟我国药物研发的现状和特色有关,由于我们化药研发起步较晚,我国的 绝大部分化药企业没有自己的药物筛选候选化合物库,而国外大型医药企业通常拥有多达上百万小分子化合物库,这决定了我国化药研发领域对斑马鱼模型需求相对较少。
包括中医在内的民族药在我国有几千年的使用历史,积累和形成了包括中医理论、藏医理论在内的大量宝贵的天然药用资源使用经验和理论,这为我们用斑马鱼进行天然药用资源提供了得天独厚的机会。跟国外科学 家通常是以从天然药物资源中分析单体活性成分为目的不同,我国的天然药用资源开发在中医理论的指导下,更加注重多种功效成分的协同作用,而基于生物整体反应的功效评价正是斑马鱼的突出优势。
早期,我国药物研发领域的科研工作者对斑马鱼的使用主要集中在天然产物的毒性和安全性评价领域,而且所做的工作相对比较简单,以简单的死亡率观察、心脏毒性、明显的形态学观察以及病理观察为主,研究成果主要发表在国内期刊[62-65]。2010 年前后,有一些国内的科研团队开始用斑马鱼进行发育毒性和神经毒性那个的研究,成果也在国外期刊发表[66,67]。同时,也开始有科研团队开始将斑马鱼应用于功效评价,早期的功效评价以抗血管形成活性为主[68-71]。从 2012 年之后,国内用斑马鱼进行药物研发的团队明显增多,而且更多的研究方向集中在了功效评价和活性物质筛选上,功效评价的范围也从抗血管形成扩展到了促血管形成[71,72]、抗炎[73,74]、抗骨质疏松[75]、行为学研究[76]、抗血栓[77] 以及中药代谢研究[78]等领域。此外,斑马鱼在中药生物学质量控制方法方面也已经进行了一些有益的探索[36,79]。
随着国家“重大新药创制”科技重大专项资助项目从十二五开始对斑马鱼药物研究技术进行资助以来,国 内有越来越多的单位开始筹建斑马鱼药物研发实验室,特别是在中药和天然药物研发领域。“重大新药创制”专项的支持对于推动斑马鱼在我国药物研发领域的应用起到了非常重要的作用,专项支持不仅给更多单位筹建 斑马鱼实验室提供了经费支持,也从国家层面推动了斑马鱼药物研发技术在国内的认可、接受与应用。国内已经涌现出了像杭州环特生物科技股份有限公司、山东省医学科学院、广东省人类疾病斑马鱼模型与新药筛选重点实验室等一批在国内外具有一定学术影响力和产业服务能力的斑马鱼技术平台。目前,我国已经有多个创新 药物项目将斑马鱼数据用于中国新药临床试验申报,并已有 2 个项目获得了临床批件。
四、展望
目前,国际上化学药物开发已经逐步并可能完全转向基于靶向设计的药物研发思路,斑马鱼在化学药物研发的应用预计不会出现非常大的增长;随着斑马鱼毒性替代模型的深入推广和应用,斑马鱼在化学药物早期安全性评价中使用应该会有所增加。
从长期来看,多组分、多靶点的多组分药物开发会成为一个趋势,这里既包括人为选择化学单体药物进行组合,也包括从天然药物筛选、发现多组分活性成分。而对于多组分药物而言,体外筛选的结果预测性有限,哺乳动物的时间和费用成本太高,斑马鱼模型能够发挥更大作用。
此外,随着国家对中医药产业的重视,中医药行业提升自身水平,加强对中药产品质量控制正在逐步成为业内共识。而目前基于化学成分检测的质量控制体系并不能完全反映出中药产品的质量好坏与稳定性,生物活性测定方法具有整体可控、药效相关等技术优势,作为符合中医药特点的适用质量控制方法已成为中药质量控制和评价的重要发展方向之一,《中国药典》2020年版编制大纲指出:“重点开展基于中医临床疗效的生物效价和测定方法研究,探索建立以形态、显微、化学成分和生物效应相结合的能整体体现中药疗效的标准体系”。
考虑到中药成分的多样性和作用机制的复杂性,体外生物学实验结果的可靠性有限,而哺乳动物实验并不适合用于大批次的常规检测,相信斑马鱼在中药质量控制体系中能够有自己用武之地。

作者:张勇

来源;中国实验动物信息网

 

 

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